自从1852年南王冯云山和西王萧朝贵相继战死后，韦昌辉在太平天国领导集团中的地位就蹭蹭往上涨，成了仅次于东王杨秀清的第三号人物，开始辅佐杨秀清处理太平天国内政。
1853年，太平军一路势如破竹，进驻江宁（今江苏南京）后，改名为“天京”，并定都于此。太平天国的军政大事，基本上都由东王杨秀清主理，韦昌辉协助执行，名为“协理天事” 。
当时保卫天京指挥部就设在北王府，韦昌辉主管军事。每到敌军攻城的时候，韦昌辉就会登上高塔红望楼指挥作战，白天吹角摇旗，夜晚悬灯传令，全城太平军民都以他的号令为准。将士们一看到号令，就会先来到北王府前，听候分派前往各门拒敌。太平军将士出征的事儿，也得先由东王杨秀清决定，然后再由韦昌辉的北王府传布命令分遣军队。可以说，在军事方面，韦昌辉的权力还是挺大的。
太平天国定制后，诸王皆受东王杨秀清节制，政权由正军师杨秀清掌控。所有的军国事务，必须先禀报给北王韦昌辉、翼王石达开，韦昌辉认为可行后，再禀奏给东王杨秀清。也就是说，韦昌辉虽然权力不小，但上面还有个杨秀清压着，大事儿还得杨秀清说了算。
这杨秀清自恃功劳大，又掌握着军政大权，渐渐变得飞扬跋扈起来。他不仅经常欺压韦昌辉，连天王洪秀全也不放在眼里，甚至还假借天父下凡，责罚天王。洪秀全虽然心里不满，但也不敢轻易发作。韦昌辉就更惨了，杨秀清三天两头找他麻烦，时不时就训斥他一顿，当众给他难堪。韦昌辉心里恨得牙痒痒，但又不敢表现出来，只能表面上对杨秀清谄媚逢迎，每次杨秀清坐轿前来，他都亲自扶轿迎接，谈论政事不到三四句，就跪谢说：“非四兄教导，小弟肚肠嫩，几乎不知道。”
1854年1月，杨秀清为了削弱韦昌辉的权力，命令他将主管军事的权力移交给自安庆返回的石达开，同时把保卫天京指挥部改到了翼王府。这还不算完，同年五月，杨秀清又命令韦昌辉前往湖北督师，可韦昌辉刚准备出发，杨秀清又私下嘱咐下属禀奏挽留他，然后临时改派韦俊、黄再兴前往湖北。八月，杨秀清再次命令韦昌辉前往湖北、安徽督师，韦昌辉刚走到采石（今安徽马鞍山），就又被调回，改派石达开前往。这一来二去的，韦昌辉就像个被杨秀清随意摆弄的棋子，心里别提多憋屈了。
更过分的是，因为韦昌辉部将张子朋引起水营兵变，杨秀清竟然亲自到北府，当着众人的面杖责了韦昌辉几百下，打得韦昌辉好几天都下不了床。这还不算完，韦昌辉的哥哥与杨秀清妻兄争夺房屋，杨秀清知道后大怒，要杀韦昌辉的哥哥，还把人交给韦昌辉处理。韦昌辉为了讨好杨秀清，竟然说不以五马分尸处置，不足以警示众人。你说这韦昌辉得有多无奈，多憋屈啊！
但韦昌辉可不是个甘心被人拿捏的主儿，他表面上对杨秀清服服帖帖，暗地里却在积蓄力量，等待着复仇的机会。
1856年，太平军攻破清军“江南大营”，太平天国的形势一片大好。可就在这个时候，东王杨秀清却飘得不知道自己是谁了，他逼迫洪秀全封其为“万岁” ，还预定于八月他生日的时候举行受封典礼。这可把洪秀全给惹毛了，洪秀全心想，你杨秀清这是要骑到我头上拉屎啊，我才是天王，你想当万岁，那我算什么？于是，洪秀全决定除掉杨秀清。
可这事儿得找个靠谱的人来干啊，找谁呢？洪秀全思来想去，想到了韦昌辉。韦昌辉是金田首义的六王之一，而且长期受杨秀清的欺辱，对杨秀清那是恨之入骨，肯定能完成这个任务。于是，洪秀全秘密下诏，命令韦昌辉、石达开等人回京诛杀杨秀清。
正在江西督师的韦昌辉接到洪秀全的密诏后，那叫一个兴奋，心里想，老子等这一天好久了，终于可以报仇雪恨了。他当即统领三千太平军，日夜兼程，从江西前线赶回天京。同时，他还与督师江苏丹阳的秦日纲约定一同返回天京。这秦日纲也对杨秀清不满，两人一拍即合。
七月二十六日夜晚，韦昌辉率部抵达天京城外，和从丹阳返回的秦日纲汇合。在陈承瑢的接应下，他们打开了天京城门，军队悄悄进入天京城。韦昌辉等人按照预定计划迅速布置，在不到两个小时内，就将城内要害据点及通往东王府的街道全部攻占。随后，韦昌辉亲自率部攻入东王府，将杨秀清和他的家人及东王府内侍从全部杀死。这一夜，东王府血流成河，曾经不可一世的东王杨秀清，就这么稀里糊涂地丢了性命。
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“天京事变”发生后的第二天清晨，韦昌辉带着杨秀清的首级前往天王府，请求洪秀全标榜公示罪状。可这时候，天京城内东王府的官员士兵还有部分未被监视，韦昌辉担心他们会报复，就想斩草除根，将他们一网打尽。于是，他想出了一个毒计，假称洪秀全降诏，说他处置杨秀清超过了诏旨，应该承受杖刑四百，并让所有杨秀清下属全部去观看他