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王政君看到这种情况，心里虽然很不痛快，但也知道不能和新皇帝硬来。于是，她选择了避让，让自己的侄子大司马王莽“乞骸骨”回家。虽然汉哀帝没有批准王莽的辞职请求，但对王氏家族却日渐疏远。
在汉哀帝的打压下，王氏家族的势力逐渐衰落。建平元年（公元前6年）秋天，曲阳侯王根与成都侯王况被查出了罪名，王根被迫返回自己的封地，王况被贬为庶民。建平二年（公元前5年），王莽也被弹劾，不得不卸职回到封地新都，闭门不出。这期间，王氏家族在朝廷中的地位一落千丈，几乎到了任人宰割的地步。
而傅氏和丁氏家族呢，在汉哀帝的支持下，开始在朝廷中飞扬跋扈起来。傅氏被尊为“帝太太后”，丁氏被尊为“帝太后”，她们的家族成员也纷纷加官进爵，掌握了朝廷的重要权力。这两大家族和王氏家族之间的矛盾越来越深，一场激烈的外戚争斗即将爆发。
就在这个时候，汉哀帝却做出了一件让人意想不到的事情。他居然爱上了一个名叫董贤的男子，而且爱得死去活来。他对董贤的宠爱，简直超乎了想象。不仅赏赐给他大量的金银财宝，还让他担任了大司马的重要职位，甚至还想把江山都送给他。这一下，可引起了朝廷上下的轩然大波。
傅氏和丁氏家族本来就对董贤得宠感到不满，现在看到汉哀帝居然要把大司马的位置让给他，更是气得七窍生烟。她们觉得董贤是个祸害，必须要除掉他。于是，她们联合起来，准备向董贤下手。
可是，汉哀帝却坚定地站在了董贤一边。他为了保护董贤，不惜和自己的祖母傅氏、母亲丁氏翻脸。这祖孙三人之间的矛盾越来越深，最终导致了傅氏含恨而终。而汉哀帝呢，也因为过度放纵自己，在元寿二年（公元前1年）病逝，年仅二十五岁。
汉哀帝的去世，让西汉朝廷再次陷入了混乱之中。而王政君，这个历经风雨的太皇太后，也再次迎来了她人生中的又一个重要转折点。
汉哀帝去世后，由于他没有子嗣，皇位一下子就空了出来。王政君得知哀帝死讯后，立刻展现出了她的果断和睿智。她迅速移驾未央宫，部署王氏子弟控制中枢，第一时间夺得传国玉玺，把持了国政。
随后，王政君诏命王莽再任大司马，录尚书事，兼管军事令及禁军。这一次，王氏家族再次掌握了朝廷的大权。在王政君和王莽的商议下，他们推举中山王刘衎继承皇位，即汉平帝。
汉平帝当时只有九岁，还是个小孩子，根本无法处理朝政。于是，王政君临朝听政，将政事都托付给了王莽处理。一开始，王莽还表现得兢兢业业，对王政君也十分恭敬。他在朝廷中推行了一系列改革措施，赢得了不少人的支持和赞誉。王政君看到王莽如此能干，也对他越来越信任，逐渐把更多的权力交给了他。
可是，随着权力的不断增大，王莽的野心也开始膨胀起来。他不再满足于仅仅做一个大司马，他想要的，是整个天下。于是，他开始一步步地谋划着篡汉自立的计划。
元始五年（公元6年），汉平帝突然驾崩，年仅十四岁。对于汉平帝的死，历史上一直存在着争议，很多人都怀疑是王莽下的毒手。但不管真相如何，汉平帝的死，无疑给了王莽一个绝佳的机会。
汉平帝死后，王莽为了方便自己掌控朝政，推举汉宣帝的玄孙、广戚侯的儿子，当时只有2岁的刘婴继位。刘婴年纪太小，根本无法理政，于是王莽就以摄政皇帝的身份，总揽朝政大权。
此时的王莽，已经完全不把王政君放在眼里了。他的野心已经暴露无遗，他想要的，就是推翻西汉，建立自己的王朝。终于，在公元9年，王莽撕下了最后的伪装，正式建立新朝，向王政君索要传国玉玺。
王政君这才如梦初醒，她终于意识到，自己一手扶持起来的侄子王莽，居然是个狼子野心的叛徒。她又惊又怒，坚决不肯交出传国玉玺。她愤怒地对王莽说：“你们父子一家承蒙汉家之力，才能世世代代都得到富贵，既没有报答他们，又在他人托孤之时，趁机夺取国家，完全不顾恩义之道。”可是，在王莽的百般威胁下，王政君最终还是无奈地摔碎了传国玉玺，以此来表达自己的愤怒和反抗。这一摔，不仅摔碎了传国玉玺的一角（后来王莽让人用黄金补上），也摔碎了西汉王朝最后的尊严和希望。
《汉书·元后传》里清清楚楚记着这一幕：“太后闻舜语，怒不肯予玺。舜固请之，太后乃出汉传国玺，投之地以授舜，曰：‘我老已死，如而兄弟，今族灭也！’”
王莽拿到玉玺后，如愿登基，改国号为“新”，西汉就此灭亡。而王政君呢？她被王莽尊为“新室文母太皇太后”，却再也没笑过。她把自己关在长乐宫的寝殿里，不许下人挂新朝的旗帜，也不许用新朝的历法，